2017年11月19日 星期日
学术论文
严重急性呼吸综合征后骨坏死的血液学改变和相关基因检测
时间: 2015-12-03 17:09:00 作者:孙伟 李子荣 史振才 张念非

    【摘要】目的 测定SARS后骨坏死患者的血液高凝和低纤溶倾向的指标变化及相关基因检测,探讨SARS后骨坏死的病因学,以便用于非创伤性骨坏死的早期诊断和易感人群的筛选。方法 取61例SARS后骨坏死患者抽取空腹肘静脉血。另取健康人群52名为对照,应用酶联免疫吸附法等方法测定凝血、纤溶指标,应用实时PCR仪测定因子V G1691A(FV Leiden)突变、凝血酶原G20210A突变。结果 SARS后骨坏死患者血液学因素改变明显,其中蛋白C(PC)、抗凝血酶III(AT-III)、纤溶酶原激活抑制物(PAI)、活化蛋白C抵抗(APC-R)、纤溶酶原(PLG),两组比较有显著性差异。骨坏死组和对照组均未发现因子V Leiden突变和凝血酶原G20210A的突变。结论 SARS后骨坏死患者存在高凝低纤溶倾向,对骨坏死易感人群可以进行高凝和低纤溶指标的筛选,PC、AT-III、PAI、APC-R、PLG可作为骨坏死易感因素的筛选指标。SARS后骨坏死与因子V Leiden和凝血酶原G20210A突变无关。
 

    关键词:骨坏死 SARS 凝血 纤溶
 

    Hematological change and related gene mutation of
 

    post-SARS patients with osteonecrosis
 

    SUN Wei, LI Zi-rong*, SHI Zheng-cai, et al. Department of Orthopaedic, China-Japan Friendship Hospital. Beijing 100029, China
Corresponding author: LI Zi-rong
 

    【Abstract】Objective To study the coagulation and fibrinolysis change and related gene mutation of post-SARS patients with osteonecrosis, investigate the etiology of post-SARS osteonecrosis, and select the sensitive molecular symbols for early diagnosis and distinguish the high risk population. Methods The studied subjects were divided into two groups. 61 post-SARS osteonecrosis patients was one group, and 52 healthy people were as normal controlled group. Empty stomach Blood samples from cubital veins were collected from both groups. Activated partial thromboplastin time(APTT), protein C(PC), antithrombin III(AT-III), plasminogen activator inhibitor(PAI), Activated protein C resistance(APC-R), plasminogen(PLG), von Willebrand factor(VWF), D-Dimer(D-D), fibrinogen(Fib) were examined by ELISA, homocysteine(tHCY)was examined by chromatographic analysis. Factor V G1691A (FV Leiden) and prothrombin G20210A mutation were detected by Real-time PCR. Results The blood agents of post-SARS patients changed obviously. APTT, PC, AT-III, PAI, APC-R, PLG were significantly different between two groups. No Factor V Leiden and prothrombin G20210A mutation were detected in both post-SARS patients and the control subjects. Conclusion Hypercoagulation and hypofibrinolysis were found in post-SARS osteonecrosis patients. Hypercoagulation and hypofibrinolysis examines can be used to screen high risk osteonecrosis population. APTT, PC, AT-III, PAI, APC-R and PLG are sensitive blood symbols for screening high risk population. There is no relationship of Factor V Leiden and prothrombin G20210A mutation with Chinese post-SARS osteonecrosis.
 

    [Key word] Osteonecrosis, SARS, Coagulation, Fibrinolysis
 

    非创伤性骨坏死的病因仍不十分清楚,上世纪70年代,Jones提出了血管内凝血(Intravascular coagulation, IC)学说,认为各种潜在危险因子激活的血管内凝血导致骨内纤维蛋白血栓形成和骨髓内出血,是骨内血栓形成和骨坏死的共同途径,本课题对SARS后骨坏死患者的血液学改变进行研究,查找骨坏死的血液学因素,为骨坏死的早期诊断和干预提供理论基础。
 

    材料与方法
 

    在2003年春的SARS感染患者中,于2003.7-2004.2进行全身多关节(双髋、双膝、双踝、双肩、部分患者加双腕)MRI,CT及X线摄片等影像学普查,由放射科医师和专业骨科医师分别阅片,作出诊断,对两组诊断意见不一的资料,则共同阅片讨论,最后得出诊断。研究对象为 61例发生骨坏死患者,其中男性25例,女性36例,平均30.4岁(20-60岁),激素(折合成甲强龙)使用量平均7706.4mg(1200-30000mg),每日最大剂量平均373.2mg(80-1020mg),使用激素时间平均40.8d(14-105d),平均冲击剂量时间(>80mg/d)30.1d(9-67d),其中股骨头坏死50例87髋(单侧13例,双37例),膝关节坏死35例63膝(单侧7例,双28例),肩关节坏死15例24肩(单侧6例,双侧9例),腕关节坏死4例7腕(单侧1例,双侧3例,舟骨7块、头状骨2块、月骨1块),单纯累及骨干1例;对照组取正常健康人群52例,男性22例,女性30例,平均35.1岁(15-61岁)。
 

    凝血检查与处理

    在获得受试者同意后,取晨起空腹血5ml/人,缓慢注入盛有3.8%枸橼酸钠的真空抽血管3ml,EDTA抗凝管2ml,抗凝剂与全血体积比为1:9,轻轻混匀,两管室温下以2000r/min的速度离心,收集上层液血浆,-80℃冰箱保存。以酶联免疫吸附法(STACompact 凝血仪 法国产)测活化部分凝血活酶时间(APTT)、蛋白C(PC)、抗凝血酶III(AT-III)、纤溶酶原激活抑制物(PAI)、活化蛋白C抵抗(APC-R)、纤溶酶原(PLG)血管假性血友病因子(VWF)、D-二聚体定量(D-D)、纤维蛋白原定量测定(Fib)。EDTA抗凝管2ml血必须在0.5h内离心后,(ORGANON TEKNIKA酶标仪 意大利产)测血浆同型半胱氨酸(tHCY)。
 

    凝血因子V G1691A(FV Leiden)和凝血酶原G20210A DNA扩增、检测取含EDTA的抗凝全血300μl,按照试剂盒说明进行全血DNA提取(A004-2 北京鼎国生物公司)。在每个罗氏荧光定量Realtime PCR仪 的毛细管加入稀释液(PCR级的H2O)、杂交探针、杂交探针荧光素、反应液2μl(含Tris-HCl Buffer、<0.01%Taq DNA聚合酶、<0.07%dATP,dCTP,dGTP,dUTP,dTTP、 Brij35和MgCl2),混合,每次取30个标本的各5μlDNA,阳性对照、阴性对照(稀释液)各一,分别置于毛细管,密封后,在Roche PCR圆盘位置1放置阴性对照,2放置阳性对照,其余位置分别放置SARS后骨坏死样本和对照组样本的DNA,上机进行扩增和检测。因子V和凝血酶原检测均行45个循环后进行溶解曲线分析。
 

    统计学处理
 

    所有数据以均数±标准差表示,应用SAS6.12和SPSS11.0统计处理软件包,采用Wilconxon 非参数检验SARS后骨坏死组和对照组的差异;而对SARS后骨坏死组和对照组超出正常范围的指标数进行统计,使用卡方检验测显著性差异。 P<0.05为差异有显著性。
 

    结 果
 

    SARS后骨坏死患者的高凝低纤溶倾向明显,61例中有54(88.52%)例患者至少出现一项凝血纤溶指标的异常,而对照组为19(36.54%)例。其中3项及以上指标异常的骨坏死组44(72.13%)例,对照组为9(14.75%)例,两组之间有显著性差异。各项指标中,骨坏死组存在PC、AT III和PLG降低, PAI升高,而APTT、vWF、Fib、D-D、HCY、APC-R和对照组在数值上无统计学差异;在各项指标出现异常的例数上PLG(62.30%)、AT III(51.67%)、PAI(44.26%)、PC(36.07%)、APC-R(13.11%)与对照组有显著性差异(见表1、2、3);骨坏死组和对照组均未发现FV Leiden突变和凝血酶原G20210A突变。

   

     讨 论
 

    近年来,对骨坏死和凝血、纤溶系统异常的关系越来越受到重视。欧美学者的大量研究表明非创伤性骨坏死与患者高凝低纤溶有密切关系〔1〕〔2〕〔3〕,Jones〔4〕认为凝血纤溶异常可能在骨坏死的发生中起了重要的作用,这种高凝低纤溶的状态并非骨坏死的直接病因,且这些因素可能是可逆或不可逆的、阈上或阈下的、附加或复合的、先天遗传或后天获得的,但可通过启动了血管内凝血这一中间机制的发生,最可能成为骨坏死发生的最后共同通路。本研究发现SARS后骨坏死患者血液也呈高凝和/或低纤溶状态。激素治疗会使患者处于"血栓前状态(prethromobotic stage)",即能导致血栓形成的异常因素而构成的血栓形成前的病理状态,患者如果本来存在高凝和低纤溶倾向,在激素治疗时将有更大的风险,导致最后骨内血循环血栓形成,产生骨坏死,这就是骨坏死的二次打击理论(Second hit theroy)。由于这批患者均为在停用激素后6-9个月进行的凝血纤溶的检查,而激素对这些指标的影响多为暂时性〔2、5〕,因此这些患者的高凝低纤溶的倾向多为本身固有的缺陷。如同时对感染SARS使用激素却没有出现骨坏死的人群,进行凝血纤溶指标的检测将会增进对骨坏死病因的了解,但由于客观原因,这些患者的血样无法取得,使本研究存在缺憾。
 

    在本研究中SARS后骨坏死患者中,有54(88.52%)例至少存在一项血栓形成倾向和低纤维蛋白溶解的血液指标异常,有44(72.13%)例的患者有两项以上异常,其中PC、AT-III、PAI、APC-R、PLG与对照组相关指标有显著性差异。这些指标可用于易感人群的筛选。这与欧美报道结论一致,但又有种族的差异性。Korompilias〔3〕 报道216例骨坏死患者中,106例进行检测,88例(83%)异常,其中APCR异常占75%,对照组仅出现7.5%异常。本研究中APCR异常发生率不如西方人报道的高,骨坏死组仅11例(12.64%)出现异常,而以低纤溶的因子PLG、PAI和高凝因子AT III、PC异常为主,考虑与种族差异有关。韩国学者Lee〔6〕报道24例股骨头坏死患者的凝血纤溶指标尽管与24例正常对照存在差异,但无统计学意义,认为是由于人种差异所致,并得出亚洲人群的凝血纤溶因素在骨坏死病因学上没有意义的结论。本研究不支持这一结论。国内郑召民〔7〕等也通过对早期和晚期股骨头坏死患者的血液学改变检测,认为国人非创伤性骨坏死患者各期均存在高凝和低纤溶状态。
 

    目前,几种导致凝血纤溶紊乱的基因突变已经明确,在骨坏死相关基因的研究上,欧美学者发现FV Leiden和凝血酶原G20210A的突变与骨坏死关系密切。FV Leiden,是由于凝血因子V基因1691位的一个点突变(G→A)而生成一种异常的F V506位点(精氨酸→谷氨酰胺)。当活化的蛋白C(APC)通过506位点的水解作用使FV降解时,被置换的506位点谷氨酰胺对APC不敏感,产生了抗活化的APC现象,降低了抗凝血作用,FV Leiden在高加索人群中是静脉血栓形成最常见的基因缺陷。凝血酶原G20210A的基因突变是在3'非翻译区20210处G→A,这能导致凝血酶原水平增高,从而使血栓形成危险性增高4~5倍。最近Bjorkman〔8、9〕发现高加索(Caucasian)人种的髋、膝关节骨坏死患者FV Leiden和凝血酶原G20210A的突变较对照人群明显增多。Charalampos〔10〕研究也表明FV Leiden是骨坏死的易感基因。本研究在SARS后骨坏死人群未能找出这两种基因突变。国内 [11]白春梅等研究发现FV Leiden和凝血酶原G20210A的突变与汉族人静脉血栓形成无关,并且发现这两种基因缺陷也不存在于正常汉族人,故不是汉族人血栓形成的遗传性危险因素。本课题结果证实了SARS后汉族人骨坏死人群与欧美报道不同,不存在FV Leiden和凝血酶原G20210A基因的突变。
 

    SARS后骨坏死患者中,存在高凝和低纤溶的血液状态,那么早期尚未出现不可逆转的塌陷之前,使用抗凝和促纤溶药物会纠正患者的血液状态,将阻断甚至逆转病程,避免手术治疗和残疾的发生。另外在需要长期和大量使用激素治疗的易感人群(如系统性红斑狼疮、器官移植、肾病)中,进行凝血和纤溶指标的筛选,在使用激素同时应用药物干预将会减少骨坏死的发生。
 

    参考文献
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